反义结缔组织生长因子对增生性瘢痕动物模型的抑制作用

　　[摘要]目的：研究结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对兔耳增生性瘢痕模型的作用，探讨增生性瘢痕的基因治。
　　方法：建立免耳增生性瘢痕动物模型，分别将生理盐水、转化生长因子β1(TGF—β1)、TGF—β1+CTOF、CTGF、ASODN作用于动物模  型。7、l 4，20天后观察瘢痕体积的变化．采用Western Blot方法检测CTGF蛋白表达情况，应用免疫组织化学染色方法检测增  生性瘢痕组织中增殖细胞核抗原(PCNA)表达、原位末端标记法(TUNED观察细胞凋亡。  结果：注射TGF—β1、CTGF后瘢痕体积，  CTGF蛋白表达、PCNA阳性表达均增高，TLNEL阳性细胞减少，其中以联合注射TGF—β1+CTGF较为显著：ASODN作用后瘢痕体积、  CTGF蛋白表达、PCNA阳性表达降低，TUNEL阳性细胞增加。结论：CTGFASODN能够有效抑制CTGF蛋白的表达和细胞增殖，并且加  快了细盹的凋亡，从而抑制癜痕增生。
 

　　[关键词]结缔组织生长因子：反义寡核苷酸：瘢痕
 

The effect of antisense CTGF in inhibting hypertrophic scar of animal model

　　Abstract：Objective To investigate the effect of antisense CTGF in inhibiting hpertrophic scar of rabbit ears and to  explore a new gene therapy to hypertrophic scar．Methods Established the model of hypertrophic scar of rabbit ears  which were injected with saline，TGF—β1，TGF—β1 and CTGF，CTGF，antisense CTGF，We observed the change of the  scar volume at 7.14 and 20 days after treatment．The expression of CTGF protein were assessed by Western blot．  Expressions of PCNA in hypertrophic scar were detected by immunohistochemical technique Apoptosis was detected  by TUNEL Results The scar volume，the expression of CTGF protein and PCNA positive cell increased after injected  TGF—β1 and CTGF，whereas TUNEL positive celI decreased．Such effects become obvious after combined injection  TGF—β1 and CTGF The scar volume，the expression of CTGF protein and PCNA positive cell decreased after injected  the antisense CTGF．whereas TUNEL positive cell increased．Conclusions The results suggest that antisense CTGF is  able to inhibit the expression of CTGF protein and the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts，meanwhile quicken  the apoptosis of fibroblasts Therefore antisense CTGF could inhibit proliferation of hypertrophic scar

　　Key words：connective tissue growth factor；antisense OIigonucIeOtide；scar
 

　　增生性瘢痕的治一直是整形外科的重要课题之一。其病理特征是伤口愈合后期成纤维细胞增殖及合成、分泌旺盛，引起细胞外基质过度沉积，目前发病机制尚不清楚。结缔组织乍长因子(CTGF)是新近发现的一种在纤维化病程中发挥重要作用的生长因子，其过度表达与某些纤维化疾病的发生、发腱密切相关。
 

　　反义寡核苷酸能以序列特异方式抑制基因表达，在治  癌症、微生物感染、自身免疫病等方面取得了可喜成绩。本实  验通过CTGF反义寡核苷酸(ASODN)对兔耳增生性瘢痕模型  的研究，以探讨增生性瘢痕的基因治。
 

　　1材料和方法
　　1．1实验动物：健康人耳白兔20只，体重1．5～2．Okg。雌雄  不限，由哈医大二院动物实验中心提供并饲养。
 

　　1．2试品和材料：TGF-βl、CTGF购自美国Peprotech公司，  山羊抗人CTGF多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根  过氧化物酶标记的兔抗羊二抗购自上海中杉生物公司，PCNA  免疫组化试品盒购自上海中山生物工程公司，细胞凋亡检测  试品盒购自德国Roche公司。
 

　　1．3 CTGF ASODN的合成：CTGF ASODN碱基序列为：5，  -TACTGGCGGCGGTCAT-3，将ODN两端的4个碱基进行硫代  磷酸化以防止ODN降解，由上海生工生物工程公司合成。
 

　　1．4兔耳增生性模型的建立：具体操作参见文献。
 

　　1．5药物注射：20只大耳白兔随机分为5组，每组4 只，于创  面上皮化后20天分别于瘢痕灶内及基底部注射药物，注射  品量均为20μl：①注射生理盐水作为对照(A组)：②注射  10μl/ml的TGF一μl(B组)；③注射lOμg／ml的TGF—μl后  第4天注射lOμg／ml的CTGF(D组)；④注射10μg／ml的CT-  GF(c组)：⑤注射20pμg／ml的ASODN(E组)。
 

　　1．6标本取材及制备：分别于注射后第7、14、20天对各组瘢  痕组织进行观察、取材及测定。其中作组织学检查，光镜标本  用lO％的甲醛固定，常规石蜡包埋切片，行PCNA、TUNEL染色：
 

　　用于Western检测的组织置于液氮中保存备用。
 

　　1．7治前后瘢痕体积大小：注射药物后7、14、20天以游标  卡尺测定瘢痕直径(a)及厚度(b)，以公式V=兀a2／4计算体  积。
 

　　1．8 Western Blot检测CTGF蛋白表达：取各组组织lOOmg，  液氮中研磨，提取蛋白质测定蛋白浓度。SDS—PACE凝胶电泳  基本参照《分子克隆实验指南》方法进行，电转移蛋白于  Hybond C膜上，5％脱脂奶粉封闭1h．加入l：1000稀释的羊  抗人CTGF抗体，室温下杂交2h，TBS洗膜后，加入l：1000  稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体，室温下lh。TBs  洗膜后，ECL增强发光，X光片感光、显影、定影，测定条带的  吸光度代表蛋白表达强度。
 

　　1．9 PCNA和TUNEL检测：PCNA检测采用免疫组化手术式链霉  素一抗生物素蛋白一过氧化物酶复合物(SP)法，细胞凋亡采  用TUNEL。法。阳性细胞经DAB染色细胞核旱棕褐色，每张切  片观察5个高倍视野，计算阳性细胞率得平均数。
 

　　1．10统计学分析：所得数据用x±s表示，以SPSS lO．0进  行方差检验。
 

　　2结果
　　2．1各组瘢痕体积变化见表l。
 

　　2．2 CTGF蛋白表达变化：Western印迹结果(治20天)见  图l、2。与注射生理盐水组相比，TGF-β1，作用后瘢痕CTGF表  达明显增加，尤其以联合注射TGF—β1+CTGF组较为显著，而  CTGF ASODN可明显抑制CTGF蛋自合成。
 

　　2．3瘢痕组织成纤维细胞增殖和凋亡的变化：结果见表2。在  增牛性瘢痕组织中，PCNA阳性表达细胞人于TUNEL阳性细  胞，TGF-β1、CTGF均可使瘢痕组织中PCNA阳性细胞增多，而  TUEL阳性细胞少，以TGF-β1+CTGF联合组较为显著(p<0．05)。
 

　　相反，CTGF ASODN作用后使组织中PCNA阳性表达细胞明显  少于TUNEL 阳性表达细胞，与对照组比较，差异有显著性意  义(P
 

　　3讨论瘢痕形成是皮肤损伤达到一定程度后组织修复的必然结果，一股情况下，与细胞、细胞外基质(ECM)和生长因子三者的相互作用有关。在创面微环境中，生长因子是重要的信号转导物，在细胞和ECM的相互作用中起着必不可少的调控作用，细胞的增殖和ECM的合成、分泌均受生长因子的影响。
 

　　因此，抑制相关生长凶子的蛋白合成，调控成纤维细胞的增殖。加速细胞的凋亡是治的主要目标。
 

　　CTGF是新近发现的重要的促纤维化生长因子，在多种纤维化疾病中表达上调，它是TGF-β1的下游介质，介导了TGF—β1的某些促细胞增牛和促ECM合成的作用。研究证实在体外人增生性瘢痕成纤维细胞中CTGF表达增高，TGF-β1可以刺激CTGF的高表达。CTGF在创伤愈合过程中的作用：①加速DNA合成、促进细胞增殖：②调节细胞外基质基因的表达；③介导细胞黏附；④刺激细胞迁移；⑤促进新生血管形成：⑥促进细胞存活、免于凋亡。因此，阻断CTGF的表达为更特异和更有效的防治纤维化提供新的思路。
 

　　反义核酸手术式的作用机制是导入某个有害基因的互补寡核苷酸，通过序列特异性和非序列特异性反义作用，与基因组相应mRNA或双链DNA结合，形成部分双链分子或三链核酸，干扰DNA结合蛋白(限制酶、转录因子)的功能，进而抑制(或阻止)基因复制和转录。反义核酸通过硫代磷酸化修饰后，增强其核酸酶抗性而增加在体内的稳定性和有效浓度，给药后能长久维持作用。
 

　　本实验结果显示，反义cTGF对治兔耳增生性瘢痕是  有效的。CTGF ASODN能够使瘢痕体积缩小，与用药时见呈正  相关。TGF-β1、CTGF能够促进瘢痕体积增大，联合注射更显  著。TGF-β1。可以促进CTGF蛋白表达，而CTGF ASODN通过抑  制CTGF转录，进而抑制其翻译成蛋白，从Western印迹结果  可见，CTGF ASODN组特异性条带强度较弱。
 

　　增殖细胞核抗原(PCNA)是近年出现的一常见用于研究  细胞增殖状态的标志物，其在细胞增殖中的作用已引起人们  的广泛注意。细胞凋亡是一种有秩序、受控制并按某种特  定程序发展的牛理性自然死亡过程，细胞凋亡参与组织损  伤与修复的整个过程，利用凋亡细胞的生化特性进行的  TuNEL手术式可用于常规组织切片细胞凋亡的原位测定，  从而促进了对细胞凋亡的研究。成纤维细胞在组织修复中增  殖与凋亡之间的平衡决定和影响着创面修复的进程、结局和  预后。实验结果证实增乍性瘢痕成纤维细胞增殖旺盛，凋亡延迟，而TGF-β1、CTGF能加大细胞增殖和凋亡的失衡，cT-GF ASODN阻断了CTGF 的促细胞增殖和免于凋亡的作用。可见，一方面，CTGF 参与成纤维细胞的增殖、分化、细胞外基质的分泌，对瘢痕形成有直接作用，另一方面CTGF又参与了瘢痕成纤维细胞的凋亡，从而间接对瘢痕的发展起作用。
 

　　综上所述，本研究利用兔耳增生性瘢痕模型，证实了CTGF ASODN对兔耳瘢痕的抑制作用，为反义核酸手术式治人增生性瘢痕的深入研究提供了动物实验资料。由于生长因子的量效关系以及其网络作用，CTGF ASODN的用药品量、用药方法以及与其他因子的相互关系有待于更深入的研究。
 

　　本文转自:中国美容医学