外源性NO对成纤维细胞影响的研究
[摘要]目的：探讨一氧化氮(Nitric Oxide，NO)供体硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)对成纤维细胞形态及凋亡的影响。
方法：将NO供体SNP制成5个不同浓度(100，200、300、400、500)μmol/L作用于成纤维细胞，观察不同时间的细胞形态变化及细胞凋亡。结果：随SNP作用浓度增高及时间延长，成纤维细胞形态呈逐渐老化状态，且数量明显减少，呈显著性负相关[y=28．943—0．858x)。成纤维细胞凋亡率300和500 μmol/L组(25．6 7±0．36和56．38±2．1 8)％明显高于空白对照组(1．35±0．26)％，具有显著性差异(P
[关键词]成纤维细胞:一氧化氮;硝普钠;细胞凋亡
Research for the effects of exogenous NO on fibroblasts
Abstract：Objective To study the effects of sodium nitroprusside(SNP)which is the donor of Nitric Oxide(N0)on cell morphology and apoptosis of fibroblasts．Methods Prepared SNP of five different concentration(100、200、300、400、500)pmol／L for acting on the fibroblasts，then the Morphologic change and apoptosis of fibroblasts were observed dynamically Results With the increase of concentration and elongation of acting time，the aging state of fibroblasts appeared more and more obviously，meanwhile the quantity of the cells decreased，showing significantly negative correlation(y=28.943—0．858x)．The apoptosis rate of fibroblasts in the 300 and 500μmol／L SNP group(25．67+_0．36 and 56．38+_2．1 8)％were obviously higher than the blank control group(1．35+_0 26)％．the difference being significant(P<0．001)．Conclusions Exogenous NO had made the number of fibroblasts decreased，the aging state seriously and the apoptosis rate increased，showing a dose and time—dependent effect．This research offers a new way of thinking on the prevention and treatment of scar
Key words：fibroblasts；nitric oxide；sodium nitroprusside；apoptosis
成纤维细胞是创面修复过程中较重要的功能细胞之一，住伤口愈合过程中迁移、增殖并分泌大量的胶原纤维及基质成分，与新乍毛细血管等共同构成肉芽组织，填补组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。成纤维细胞功能异常时可致病理性瘢痕的形成，表现为瘙痒、刺痛等症状，从而影响美观、降低患者生活d质量。迄今为止，病理性瘢痕尚无有效的治方案，是美容整形外科中较棘手的问题之一。一氧化氮(N0)是具有高度生物活性的无机小分子，参与人体多种牛理及病理反应，并在创面愈合和搬痕的形成过程中起调控作用。一旦其调节作用失控、细胞凋亡信号途径遭破坏，就会引发疾病。随着细胞生物学和分子生物学领域的深入研究，细胞凋亡在瘢痕发发生发腱中的作用越来越受到研究者的关注。本文通过观察外源性N0供体硝普纳(SNP)对成纤维细胞的作用，探索二者之间的关系，从而为外源性NO用于临床瘢痕治提供理论依据。
1材料和方法
1．1材料：II型胶原酶(Serva公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、硝普钠(SNP，Sigma公司)，脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口未端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dLTP nick end 1abeling，TUNEL)法检测细胞凋亡试品盒。
1．2方法
1．2．1成纤维细胞的制备：将无菌手术切取的皮肤组织洗净，刮除卜皮，剪为lmm2人小的组织块，置于离心管中，用0．3％的II犁胶原酶消化2h。以1 500r．min速度离心5 min，弃上清。PBS清洗后台盼蓝染色计数，选取细胞活力>85％的细胞。
1．2．2 SNP对成纤维细胞作用的实验：取制备好的成纤维细胞悬液，分为6组，每组0．5ml，依次加入0．5ml lOOμM、200μM、300μM、400μM、500μM SNP、PBS液(对照组)，置于37。C 5％C02孵符中孵育5天，光学双目显微镜下观察细胞形态的变化情况。
1．2．3成纤维细胞凋凋亡的检测：于各浓度一时间点取SNP作用后的成纤维细胞悬液，分别涂于3张L-多聚赖氨酸处理的载玻片上，晾干后于40g／L多聚甲醛室温下固定lh。PBS液冲洗，滴加TUNEL标记溶液，37。C孵育lh后再以PBS液冲洗，DAB显色，封片镜检。有棕褐色颜色反应者为凋亡的成纤维细胞，于显微镜F计数阳性细胞的、平均百分率。
1．2．4统计学分析：实验数据以(X±S)表示，组间比较采用t检验，所有数据采用SPSSll．0软件包进行分析。
2结果
2．1小l叫浓度SNP对成纤维细胞影响脱察：成纤维细胞数量随SNP浓度增高及时问延长而明显减少，成纤维细胞与NO含量呈显著性负相关(y=28．943-0．858x)。SNP300μM、500μM组与空白对照组相比，细胞数显著减少，且细胞形态呈逐渐老化状态(P<0．001)。
2．2 SXP对成纤维细胞凋亡的影响：各SNP处理组的成纤维细胞凋亡率随作用时问的延长而增加(P<0．01)，在同一时间内各SNP处理组的成纤维细胞凋亡率随浓度增加加增加(P<0．01)。SNP 300和500 μmol／L处理组的成纤维细胞凋亡率与对照组比较，具有显著性差异(P
3讨论创面愈合与瘢痕形成过程受许多生长因子调控。NO足体内重要的信息分子和效应分子，在细胞信息传递、细胞防御和损伤过程中可通过多种途径诱导细胞凋亡，从而参与机体多种生理、病理调控。近年来，有研究发现，在肺、齿龈、角膜以及皮肤成纤维细胞中，均有NO的存在。创伤愈合早期，皮肤基底组织中NO含量增多，通过促进胶原合成，预防感染，进而促进伤口愈合和修复，而愈合后期即瘢痕增生期，组织中N0含毓减少，其可能原因是增生性瘢痕组织中转化生长因子-β(TGF-β)的表达异常活跃且活性增高，TGF-β可通过抑制NO／cGMF信号来保证其对真皮成纤维细胞胶原合成的刺激作用。细胞凋亡是多细胞有机体为了调控机体发育、维护内环境稳定，而由基因控制的细胞主动死亡过程，是多细胞乍物乍命活动过程中不可缺少的组成内容。病理性瘢痕的发生与成纤维细胞的异常增殖及凋亡不足密切相关，因而促进细胞凋Z亡是治增生性瘢痕的有效手段。
本实验的结果显示NO对成纤维细胞的作用具有时间浓度依赖效应，细胞形态逐渐老化，细胞数量显著少于对照组(p<0．01)，提示适量NO对伤口愈合有促进作用。历峰等提出，正常胚胎兔皮肤中NO显著高于成年兔，高浓度NO有利于降低胶原过度合成，使胎兔在创伤愈合过程中无瘢痕形成愈合，本实验结论与此观点相吻合。本文采用TLNEL法检测SNP不同浓度及时M点处理的成纤维细胞，发现成纤维细胞的凋亡率均随作用时间的延长及浓度的增加而增加，结果明显高于对照组(P<0．01)，表明NO 可促进成纤维细胞凋亡，且 具有时间品量依赖性。尚有研究表明，与正常皮肤组织相比，瘢痕疙瘩的成纤维细胞凋亡相关基因呈低表达水平凋亡诱导因子具有显著的抵抗性，说明瘢痕组织中成纤维细胞凋亡率的减低可能是瘢痕形成的原因之一。Blazic等认为瘢痕治效果不佳，是由于人为诱导凋亡不足，或是因为诱导凋亡过度使其他种类细胞死亡，这些死亡细胞义引发新的修复过程，从而造成延迟性增生。研究组织中NO水平和成纤维细胞凋亡的调控，可能为瘢痕防治开辟了一条新思路，伤口局部应用NO的作用有待进一步研究。
本文转自:中国美容医学
